1. Khái niệm về hồng cầu lưới (Ret), tỷ lệ hồng cầu lưới non (IRF) và phân loại
RET (Reticulocyte) hay còn gọi là hồng cầu lưới, là những tế bào hồng cầu chưa trưởng thành, bên trong tế bào vẫn còn 1 lượng RNA và không có nhân. Chúng thường sẽ tồn tại trong vòng tuần hoàn từ 24 đến 48 giờ trước khi biệt hóa thành hồng cầu trưởng thành. Trong trường hợp thiếu máu, dựa vào số lượng RET ta có thể đánh giá tủy xương có đang đáp ứng tái tạo hồng cầu hay không.
RET thường được chia thành 2 loại, bao gồm hồng cầu lưới kết tụ (Aggregate Reticulocyte) và hồng cầu lưới đốm (Punctate Reticulocyte).
Hồng cầu lưới kết tụ (Aggregate Reticulocyte): Là những tế bào hồng cầu lưới non, chưa trưởng thành, với kích thước lớn, lượng RNA còn nhiều, và có dạng kết tụ.
Hồng cầu lưới đốm (Punctate Reticulocyte): Còn được coi là những tế bào hồng cầu lưới trưởng thành, lượng RNA ít và thường chỉ thấy những chấm nhỏ khi quan sát kính hiển vi.
IRF (Immature Reticulocyte Fraction) là tỷ lệ tế bào hồng cầu lưới chưa trưởng thành (chứa nhiều RNA), được xác định bằng mức độ bắt màu huỳnh quang của RNA trong tế bào hồng cầu lưới chưa trưởng thành, tế bào hồng cầu lưới càng ít bắt màu thì càng trưởng thành.
Có 3 loại hồng cầu lưới:
LFR (Low-fluorescence reticulocytes) – Hồng cầu lưới có cường độ huỳnh quang thấp.
MFR (Medium-fluorescence reticulocytes) – Hồng cầu lưới có cường độ huỳnh quang trung bình.
HFR (High-fluorescence reticulocytes) – Hồng lưới có cường độ huỳnh quang cao.
Trong đó IRF được định nghĩa là tổng phần trăm của MFR và HFR. LFR thì chủ yếu là những tế bào hồng cầu lưới đã trưởng thành.
Hình 1: Quá trình sản sinh hồng cầu
2. Ý nghĩa của RET và IRF
RET:
- Đánh giá số lượng Hồng cầu lưới giúp ta thấy được phản ứng của tủy xương với tình trạng thiếu máu, từ đó phân loại thiếu máu tại tạo (regenerative anemia) hay thiếu máu không tái tạo (non-regenerative anemia).
- Trong trường hợp thiếu máu thiếu sắt (Iron deficiency anemia), ta có thể thấy chỉ số RET – HBG (Nồng độ hemoglobin trong hồng cầu lưới) giảm.
- Mất khoảng từ 2 – 5 ngày sau khi mất máu thì số lượng RET mới tăng.
IRF:
- IRF để chỉ tỷ lệ tế bào hồng cầu lưới non, nên chỉ số này sẽ tăng trước RET, nên ta sẽ đánh giá sớm thiếu máu tái tạo ngay cả khi RET chưa tăng lên. Tránh sự nhầm lẫn trong chẩn đoán khi chỉ đánh giá qua RET.
- IRF còn giúp chúng ta đánh giá mức độ hoạt động hiện tại của tủy xương, có đang đáp ứng mạnh với tình trạng thiếu máu hay không.
- Theo một nghiên cứu thì những tế bào hồng cầu lưới dạng kết tụ (Aggregate reticulocytes) ở chó và mèo sẽ xuất hiện trong khoảng 48h.
3. Phương pháp đo lường RET và IRF
Để đánh giá hồng cầu lưới ở thú nhỏ, có thể sử dụng hai phương pháp chính: phương pháp thủ công và phương pháp tự động. Phương pháp thủ công đòi hỏi nhuộm mẫu máu bằng các thuốc nhuộm như methylene blue hoặc brilliant cresyl blue, sau đó đếm số lượng hồng cầu lưới dưới kính hiển vi. Trong khi đó, phương pháp tự động sử dụng máy phân tích huyết học hiện đại, áp dụng thuốc nhuộm huỳnh quang đặc hiệu giúp nhận diện phần RNA còn sót lại trong hồng cầu lưới.
Khi so sánh hai phương pháp, mặc dù phương pháp tiêu chuẩn để xác định số lượng RET là đếm và nhuộm thủ công nhưng kỹ thuật này dễ xảy ra sai số thống kê và kết quả phụ thuộc nhiều vào kỹ năng của người thao tác, đồng thời cần đếm tối thiểu 1.000 hồng cầu lưới để đảm bảo độ chính xác. Ngược lại, máy phân tích tự động có thể phát hiện tín hiệu huỳnh quang trong vòng chưa đến một phút, cho phép xử lý nhanh chóng, chính xác và đảm bảo tính nhất quán của kết quả phân tích.
(A)
(B)
Hình 2: Các phương pháp đo lường hồng cầu lưới
(A) Phương pháp thủ công đếm hồng cầu lưới dưới kính hiển vi được nhuộm bằng methylene blue, bao gồm hồng cầu lưới đốm (mũi tên trắng) và hồng cầu lưới kết tụ (mũi tên đen)
(B) Phương pháp sử dụng máy huyết học tự động chuyên dụng đếm hồng cầu lưới
Các công nghệ thường được sử dụng trong máy huyết học để phân tích tế bào bao gồm: phương pháp trở kháng, phương pháp đo dòng chảy tế bào bằng Laser, công nghệ tán xạ ánh sáng và huỳnh quang để phân tích các tế bào máu chính xác và hiệu quả.
(A)
(B)
(C)
Hình 3: Các công nghệ được tích hợp để đếm tế bào trong máy huyết học cao cấp
(A) Công nghệ đo bằng trở kháng
(B) Công nghệ đo dòng chảy chảy tế bào bằng tán xạ Laser
(C) Công nghệ tán xạ ánh sáng và huỳnh quang
4. Biểu đồ tán xạ (Scattergram) của hồng cầu lưới
Với công nghệ đo dòng chảy tế bào bằng tán xạ Laser kèm theo công nghệ tán xạ ánh sáng và huỳnh quang hiện nay, việc đo và phát hiện các tế bào đặc biệt là hồng cầu lưới (Ret) dần trở nên chính xác và dễ dàng hơn giúp xác định được các giai đoạn sinh trưởng của hồng cầu lưới bằng cách dựa vào cấu trúc RNA trong tế bào, bao gồm HFR, MFR và LFR.
Hình 4: Biểu đồ tán xạ hồng cầu lưới (dạng 2D) (1) Hồng cầu trưởng thành (Mature RBC), (2) Tế bào hồng cầu lưới (Ret cell), (3) Tế bào bạch cầu (WBC-O), (4) Tế bào tiểu cầu (PLT-O)
Hình 5: Biểu đồ tán xạ hồng cầu lưới (dạng 3D). Trong đó bao gồm: RBC: hồng cầu trưởng thành, LFR: hồng cầu lưới có cường độ huỳnh quang thấp, MFR: hồng cầu lưới có cường độ huỳnh quang trung bình, HFR: hồng cầu lưới có cường độ huỳnh quang cao, RET: hồng cầu lưới, PLT: tiểu cầu. Biểu đồ dạng 3D gồm 3 trục: FS (Forward Scatter): tán xạ trước, SS (Side Scatter): tán xạ bên, FL (Fluorescent): tín hiệu huỳnh quang
Dựa vào biểu đồ tán xạ hồng cầu lưới, ta có thể phát hiện các tế bào hồng cầu lưới trong từng giai đoạn phát triển. Trong đó, tỷ lệ hồng cầu lưới chưa trưởng thành (IRF – Immature Reticulocyte Fraction) được tính bằng tổng tỷ lệ hồng cầu lưới có cường độ huỳnh quang trung bình (MFR) và tỷ lệ hồng cầu lưới có cường độ huỳnh quang cao (HFR). Ngoài ra, biểu đồ cũng thể hiện sự phân bố của tiểu cầu và tiểu cầu chưa trưởng thành được đo bằng phương pháp huỳnh quang.
Các trục của biểu đồ mang ý nghĩa khác nhau: tán xạ trước (FS) – phát hiện kích thước tế bào, tán xạ bên (SS) – phát hiện hạt nội bào/độ phức tạp của tế bào, tín hiệu huỳnh quang (FL) – phát hiện hàm lượng axit nucleic nội bào. Trong biểu đồ tán xạ hồng cầu lưới dạng 2D, trục tung (FS) đại diện cho kích thước tế bào, tế bào càng lớn thì càng nằm ở vùng trên của biểu đồ và tế bào càng nhỏ càng nằm vùng bên dưới của biểu đồ. Trong khi đó, trục hoành (FL) tương ứng với tín hiệu huỳnh quang trong tế bào, tế bào càng nhiều axit nucleic nội bào sẽ nằm phía bên phải của biểu đồ, ngược lại các tế bào chứa ít axit nucleic sẽ nằm bên trái của biểu đồ.
Một số biểu đồ tán xạ hồng cầu lưới thường gặp:
Hình 6: Tăng hồng cầu lưới: thường xảy ra trong thiếu máu tái tạo. Do hoạt động của tủy xương diễn ra mạnh, một lượng lớn hồng cầu lưới được giải phóng vào mạch máu ngoại vi, dẫn đến tăng Ret%. Trong trường hợp này, IRF là một chỉ số rất nhạy. Ret% và Ret# sẽ tăng khi có xuất huyết qua trung gian miễn dịch, tổn thương Oxy hóa hồng cầu hoặc các bệnh nghiêm trọng (viêm nặng, nhiễm trùng, ung thư,…)
Hình 7: Giảm hồng cầu lưới: thường xảy ra trong thiếu máu không tái tạo, Ret% và Ret# sẽ giảm khi có bệnh lý về tủy xương, giảm Erythropoetin (EPO) do bệnh thận mãn tính, …
Tài liệu tham khảo:
1. SEED Veterinary Haematology
2. The Immature Reticulocyte Fraction (IRF) in the Sysmex XN-1000V Analyzer Can Differentiate between Causes of Regenerative and Non-Regenerative Anemia in Dogs and Cats
https://doi.org/10.3390/ani14020349
3. Khoa học kỹ thuật thú y tập XXVIII Số 8 – 2021
https://vjol.info.vn/index.php/kk-ty/article/download/68244/57727/
4. The Importance of RET-He in the Diagnosis of Iron Deficiency and Iron Deficiency Anemia and the Evaluation of Response to Oral Iron Therapy
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6708300/
5. Clinical utility of immature reticulocyte fraction for identifying early red blood cell regeneration in anemic dogs
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jvim.16641
6. BC60R Vet – Auto Hematology Analyzer Operator’s Manual
